脂联素通过mTOR信号通路对骨肉瘤细胞增殖凋亡的影响及机制研究

【摘要】第一部分脂联素对骨肉瘤细胞增殖及凋亡的作用影响摘要目的：探讨脂联素对骨肉瘤细胞增殖、凋亡等功能的具体作用影响及其机制。方法：免疫印迹(WB)检测三种不同入骨肉瘤细胞株(MG-63、Saos-2、U20S)及正常人成骨细胞株hFOB1.19中脂联素受体(AdipoR1、AdipoR2)表达情况；用不同浓度脂联素干预处理三种不同骨肉瘤细胞株,CCK-8法检测细胞增殖并筛选出对脂联素敏感的细胞株及适宜的脂联素干预浓度。根据上述筛选结果,用脂联素处理骨肉瘤敏感细胞株后,流式细胞术检测细胞周期变化,TUNEL和DAPI双染法检测细胞凋亡情况,WB法检测细胞周期相关蛋白CyclinD1及凋亡相关蛋白Caspase-3表达情况。结果①WB显示两种脂联素受体(AdipoR1、AdipoR2)在三种人骨肉瘤细胞株(MG-63、Saos-2、U2OS)及正常人成骨细胞株hFOB1.19中均有表达。其中MG-63、Saos-2、U2OS中AdipoR1的表达均显著高于hFOB1.19中表达(p<0.05)；Saos-2细胞中AdipoRl表达量最高,其与MG-63及U20S细胞相比,差异均具有统计学意义(p<0.05)；Saos-2细胞中AdipoR2表达水平亦最高,与hFOB1.19相比差异具有统计学意义(p<0.05)；MG-63、U20S及hFOB1.19细胞中AdipoR2表达量无显著差异(p>0.05)。②CCK-8法检测不同浓度脂联素以不同时间处理三种人骨肉瘤细胞株(MG-63、Saos-2、U2OS)后OD值变化,并计算相应浓度及时间对骨肉瘤细胞的抑制率。结果显示脂联素对三种骨肉瘤细胞均具有增殖抑制作用,且该效应具有剂量依赖性。当脂联素浓度达20ug/ml后,再增加其剂量,其对细胞增殖抑制率的增幅下降,表明其作用剂量达到相对平台期。相同浓度脂联素以相同时间处理不同骨肉瘤细胞株,其对MG-63细胞增殖抑制率最高,表明MG-63细胞对脂联素刺激敏感性最高。③流式细胞术检测脂联素干预骨肉瘤细胞后细胞周期变化,结果显示与空白对照组相比,10ug/ml脂联素处理组中细胞G0/G1期比例上升,但差异并不显著(p>0.05),但其S期比例有显著下降(p<0.01)。与空白对照组相比,20ug/ml脂联素处理组细胞G0/G1期比例显著上升(p<0.05),G2期与S期比例则均显著下降(p<0.01；p<0.01)。与10ug/ml脂联素处理组相比,20ug/ml脂联素处理组细胞G0/G1期比例显著上升(p<0.01),其G2期与S期比例均显著下降(p<0.01；p<0.01)。④TUNEL与DAPI共染检测脂联素处理骨肉瘤细胞后细胞凋亡率变化,结果显示与空白对照组(2.57±0.44%)相比,10ug/ml脂联素处理组(6.52±0.878%)与20ug/ml脂联素处理组(8.24±0.11%)细胞凋亡率均明显增加,且差异具有统计学意义(p<0.01)。⑤WB检测脂联素处理骨肉瘤细胞后细胞周期相关蛋白CyclinD1与凋亡相关蛋白Caspase-3变化,结果显示,经脂联素处理后,与空白对照组(1.276±0.081)相比,10ug/ml脂联素处理组(0.995±0.113)与20ug/ml脂联素处理组(0.904±0.095)细胞中CyclinD1表达均显著降低(p<0.01；p<0.01)。20ug/ml脂联素组中CyclinD1表达比10ug/ml脂联素处理组表达更低,但差异不具有统计学意义(p>0.05)。此外,与空白对照组(0.794±0.033)相比,10ug/ml脂联素处理组(1.027±0.083)与20ug/ml脂联素处理组(1.069±0.142)中Caspase-3表达均显著升高(p<0.05；p<0.01)。20ug/ml脂联素处理组中Caspase-3表达比10ug/ml脂联素处理组表达更高,但差异不具有统计学意义(p>0.05)。结论：两种脂联素受体(AdipoR1及AdipoR2)在人骨肉瘤细胞株及正常人成骨细胞中均有表达,不同骨肉瘤细胞株中脂联素受体表达量亦不同；脂联素对骨肉瘤细胞具有增殖抑制和促进凋亡等作用,且该作用具有剂量依赖性,其对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响可能与调控CyclinD1及Caspase-3表达相关。第二部分脂联素通过mTOR信号通路影响骨肉瘤细胞增殖凋亡的作用机制探讨摘要目的：通过mTOR信号通路探讨脂联素对骨肉瘤细胞增殖凋亡的具体作用机制。方法：用不同浓度脂联素,以不同干预时间处理骨肉瘤敏感细胞株MG-63,蛋白印迹(WB)检测mTOR下游信号通路靶蛋白p70S6K1、p-p70S6K1(Thr389)、4EBP1、p-4EBP1(Thr37/46),以及mTOR上游信号通路蛋白Akt、p-Akt(Ser473)等蛋白表达变化；通过慢病毒转染mTOR上游激活子一Rheb1过表达骨肉瘤MG-63细胞株中mTOR,或以PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002干预骨肉瘤MG-63细胞株中mTOR信号通路,再行脂联素干预,WB法检测MG-63细胞中细胞增殖相关蛋白CyclinD1及凋亡相关蛋白Caspase-3等表达变化情况。结果：脂联素能呈剂量依赖性和时间依赖性抑制骨肉瘤MG-63细胞中mTOR下游信号通路,表现为mTOR下游信号蛋白p70S6K1(Thr389)、4EBP1(Thr47/46)磷酸化水平呈剂量依赖性或时间依赖性梯度下降。脂联素亦能呈剂量依赖性和时间依赖性下调mTOR上游信号通路,表现为Akt(Ser473)磷酸化水平呈剂量依赖性或时间依赖性梯度下降。慢病毒转染过表达Rheb1激活骨肉瘤MG-63细胞mTOR后,再行脂联素刺激,其细胞周期相关蛋白CyclinD1下降幅度减小,且凋亡相关蛋白Caspase-3上升幅度减小,表明活化mTOR通路后脂联素对骨肉瘤细胞增殖抑制及凋亡诱导作用减弱；脂联素与PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002对骨肉瘤MG-63细胞株的增殖抑制或凋亡诱导作用具有协同效应。结论：脂联素可能通过抑制Akt磷酸化,阻断mTOR信号通路,进而抑制CyclinD1表达,并促进Caspase-3表达,从而抑制骨肉瘤细胞增殖并促进细胞凋亡,起到抑制骨肉瘤细胞生长的作用。图34幅,表1个,参考文献87篇
【作者】涂超；
【导师】王万春；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】脂联素；脂联素受体；骨肉瘤；增殖；凋亡；mTOR信号通路；

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